近年来,细胞与基因治疗(Cell & Gene Therapy, CGT)领域迎来了重要的突破。以anti-CD19和BCMA为代表的多种CAR-T免疫细胞疗法在血液瘤治疗中取得了显著成果,而基于AAV载体的基因疗法则为罕见病患者提供了新的治疗选择。此外,CRISPR基因编辑技术的发展开启了基因治疗的新时代,其中体外基因编辑疗法CTX001即将上市,体内基因编辑疗法展现出良好的临床效果。不过,CRISPR技术的安全性问题引起了广泛关注,因为其直接影响基因组DNA,任何不精确的修改都有可能导致长期风险。因此,FDA及其他监管机构针对基因治疗的安全性制定了指南,着重于两个方面:一是对基因组完整性的评估,二是识别脱靶编辑活动。
脱靶效应(Off-target Effect)意味着在基因编辑过程中,CRISPR-Cas9等工具可能错误地作用于其他非目标位点,导致意外的基因组改变。为了确保基因编辑的安全性与有效性,科学家们已开发出多种检测脱靶效应的方法,主要分为体内和体外检测方法。
体内检测技术
体内检测技术指的是在活细胞或生物体内评估脱靶效应。这些方法通常更贴近真实的生物环境。其中,GUIDE-seq(Genome-wide Unbiased Identification of DSBs Enabled by Sequencing)是一种有效的检测工具,通过引入双链寡核苷酸标记物识别潜在的脱靶位置。其优势在于能够提供全基因组的脱靶位点信息,以及直接检测体内真实的双链断裂事件。然而,其操作复杂,对技术水平要求较高。
DISCOVER-Seq
DISCOVER-Seq(Disruption of Cas9 binding sites followed by sequencing)是一种创新性方法,通过监测Cas9蛋白与DNA结合位点的变化来识别潜在的脱靶位点。该技术因其在活细胞环境中的实时监控能力而备受关注,但实验设计复杂,对特定细胞的适用性有所限制。
体外检测技术
体外检测技术则是在实验室中进行,主要使用从生物体提取或合成的材料。Digenome-seq是一种高通量测序方法,能够准确发现脱靶位点,但对细胞内环境发生的脱靶事件可能会有所遗漏。SITE-Seq和CIRCLE-seq进一步提高了脱靶位点的检测效率。值得一提的是,AID-seq作为一种超灵敏特异的检测方法,显著降低了假阳性率,适合于各种脱靶检测场景。
全基因组测序(WGS)
全基因组测序(Whole Genome Sequencing, WGS)技术也为基因组各类变异的分析提供了重要手段。这种技术适用于基础研究、医学诊断及个性化医疗等领域,但数据处理复杂,对计算资源和分析能力有较高要求。
RNA测序(RNA-seq)
RNA测序(RNA-seq)利用高通量测序技术分析转录组,提供基因表达水平、转录本结构等信息,对于基础生物学研究和医学研究具有重要意义。然而,数据的复杂性和成本仍是该方法的一大挑战。
在实际应用中,需要结合多种检测方法全面评估CRISPR技术的脱靶风险。为此,尊龙凯时推出了一站式基因编辑安全性评估平台,覆盖靶点设计、脱靶检测、基因组变异检测等多种管线,旨在为客户提供高效、安全的服务。
此外,尊龙凯时还研发了一种切割效率高、脱靶效应低的新型CRISPR系统—FrCas9,已获多国专利,为基因编辑技术的安全性和可靠性提供了强有力的支持。
综上所述,尽管CRISPR技术面临脱靶效应的挑战,通过持续的技术创新与严格的安全评估,行业前景依然广阔。未来,尊龙凯时期待与各界共同推动基因治疗的进步,造福更广泛的患者群体。